Métodos para a purificação de proteínas

Uma parte importante da pesquisa de biotecnologia é usar técnicas de engenharia protéica para projetar ou modificar proteínas com propriedades otimizadas para aplicações industriais específicas. Para isso, esse cientista deve ser capaz de isolar e purificar proteínas de interesse para que suas conformações, especificidades de substrato, reações com outros ligandos e atividades específicas possam ser estudadas.

O grau de pureza da proteína requerido depende do uso final pretendido da proteína.

Para algumas aplicações, um extrato bruto é suficiente. No entanto, para outros usos, como em alimentos e produtos farmacêuticos, é necessário um alto nível de pureza. Para conseguir isso, vários métodos de purificação de proteínas são tipicamente usados, em uma série de etapas de purificação.

Cada passo de purificação de proteína geralmente resulta em algum grau de perda de produto. Portanto, uma estratégia ideal de purificação de proteína é aquela em que o maior nível de purificação é alcançado no menor número de etapas. A seleção das etapas a serem utilizadas depende do tamanho, carga, solubilidade e outras propriedades da proteína alvo. As seguintes técnicas são mais apropriadas para a purificação de uma única proteína citosólica. A purificação dos complexos de proteína citosólica é mais complicada e geralmente requer que sejam aplicados diferentes métodos.

Primeiros passos para a purificação de proteínas

O primeiro passo na purificação de proteínas intracelulares (dentro da célula) é a preparação de um extrato bruto .

O extrato conterá uma mistura complexa de todas as proteínas do citoplasma celular e algumas macromoléculas, cofatores e nutrientes adicionais. O extrato bruto pode ser usado para algumas aplicações na biotecnologia, no entanto, se a pureza for um problema, as etapas de purificação subseqüentes devem ser seguidas. Os extratos de proteínas brutas são preparados pela remoção de detritos celulares gerados pela lise celular, que é conseguida usando produtos químicos e enzimas, sonicação ou uma imprensa francesa.

Os restos são removidos por centrifugação e o sobrenadante é recuperado. As preparações brutas de proteínas extracelulares podem ser obtidas simplesmente removendo as células por centrifugação.

Para determinadas aplicações de biotecnologia, existe uma demanda de enzimas termoestáveis ​​ : enzimas que podem tolerar altas temperaturas sem desnaturação e mantendo uma atividade específica elevada. Os organismos que os produzem às vezes são chamados de extremófilos. Uma abordagem fácil para a purificação de uma proteína resistente ao calor é desnaturar as outras proteínas na mistura por aquecimento, depois arrefecer a solução (permitindo assim que a enzima termostática se reformule ou redissolve, se necessário). As proteínas desnatadas podem então ser removidas por centrifugação.

Etapas de purificação intermediárias

No passado, um segundo passo comum para a purificação de uma proteína de um extrato bruto foi precipitação em uma solução com alta força osmótica (i.e. soluções de sal). Os ácidos nucleicos no extracto bruto podem ser removidos por agregados de precipitação formados com sulfato de estreptomicina ou sulfato de protamina. A precipitação de proteínas geralmente é feita usando sulfato de amônio como o sal.

Diferentes proteínas precipitarão em diferentes concentrações de sulfato de amônio .

Em geral, proteínas de maior peso molecular precipitam em concentrações mais baixas de sulfato de amônio. A precipitação com sal geralmente não leva a uma proteína altamente purificada, mas pode ajudar a eliminar algumas proteínas indesejadas em uma mistura e a concentrar a amostra. Os sais na solução são então removidos por diálise através de tubos de celulose porosa, filtração ou cromatografia de exclusão de gel.

Os protocolos modernos de biotecnologia muitas vezes aproveitam os muitos kits comercialmente disponíveis que oferecem soluções prontas para procedimentos padrão. A purificação de proteínas é frequentemente realizada utilizando filtros e colunas de filtração de gel preparadas. Tudo o que você precisa fazer é seguir as instruções e adicionar o volume certo da solução certa e aguardar o período de tempo especificado ao coletar o eluente (o que sai na outra extremidade da coluna) em um tubo de ensaio fresco.

• Os métodos cromatográficos podem ser aplicados usando colunas de bancada ou equipamentos automáticos de HPLC. A separação por HPLC pode ser feita por métodos de fase inversa, permuta iónica ou exclusão de tamanho e amostras detectadas por matriz de diodos ou tecnologia laser.

  Visualização de Proteínas e Avaliação de Purificação

  • A cromatografia de fase reversa (RPC) separa as proteínas com base em suas relativas. Esta técnica é altamente seletiva, mas requer o uso de solventes orgânicos. Algumas proteínas são permanentemente desnaturadas por solventes e perderão funcionalidade durante o RPC. Portanto, esse método não é recomendado para todas as aplicações, especialmente se for necessário que a proteína alvo retive a atividade.
  • A cromatografia de permuta iónica refere-se à separação de proteínas com base em carga . As colunas podem ser preparadas para troca de aniões ou troca de catiões. Anion exchange contém uma fase estacionária com carga positiva que atrai proteínas carregadas negativamente. As colunas Cation exchange são as contas reversas, carregadas negativamente, que atraem proteínas carregadas positivamente. A eluição da (s) proteína (s) alvo é feita alterando o pH na coluna, o que resulta em uma alteração ou neutralização dos grupos funcionais carregados de cada proteína.
  • A cromatografia de exclusão de tamanho ( filtração em gel ) separa proteínas maiores de pequenas, uma vez que as moléculas maiores viajam mais rapidamente através do polímero reticulado na coluna de cromatografia. As proteínas grandes não se encaixam nos poros do polímero enquanto as proteínas menores fazem, e demoram mais para viajar através da coluna de cromatografia, através da sua via menos direta. O eluído é coletado em uma série de tubos que separam proteínas com base no tempo de eluição. A filtração em gel é uma ferramenta útil para concentrar uma amostra de proteína, uma vez que a proteína alvo é coletada em um volume de eluição menor do que foi adicionado inicialmente à coluna.Técnicas de filtração semelhantes podem ser usadas durante a produção de proteínas em larga escala devido à sua relação custo-eficácia.
  • A cromatografia de afinidade é uma técnica muito útil para "polir" ou completar o processo de purificação de proteínas. As pérolas na coluna de cromatografia são reticuladas a ligandos que se ligam especificamente à proteína alvo. A proteína é então removida da coluna por enxaguamento com uma solução contendo ligandos livres. Este método fornece os resultados mais puros e a maior atividade específica em comparação com outras técnicas.
• SDS-PAGE é a eletroforese em gel de poliacrilamida, realizada na presença de SDS (dodecilsulfato de sódio) que se liga a proteínas que lhes dão uma grande carga negativa líquida. Uma vez que as taxas de todas as proteínas são bastante iguais, esse método as separa quase inteiramente com base no tamanho. SDS-PAGE é freqüentemente usado para testar a pureza da proteína após cada passo de uma série. À medida que as proteínas indesejadas são gradualmente removidas da mistura, o número de bandas visualizadas no gel SDS-PAGE é reduzido, até que apenas uma banda represente a proteína desejada.
• Imunoblotting é uma técnica de visualização de proteínas aplicada em combinação com cromatografia de afinidade. Anticorpos para uma proteína específica são utilizados como ligandos numa coluna de cromatografia de afinidade. A proteína alvo é retida na coluna e depois removida lavando a coluna com uma solução de sal ou outros agentes. Os anticorpos ligados a rótulos radioativos ou colorantes ajudam na detecção da proteína alvo uma vez que são separados do resto da mistura.

Fontes:

Zubay G. 1988. Bioquímica, 2ª edição. Macmillan Publishing Co., Nova Iorque, NY, EUA.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manual de Purificação de Proteínas, Edição AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Nova Jersey, EUA. // www. bioquímica. uiowa. edu / donelson / Database% 20items / protein_purification_handbook. pdf.