Técnicas para seqüenciamento de DNA

O campo da biotecnologia é uma mudança constante. O rápido crescimento e desenvolvimento de pesquisas de ponta dependem da inovação e criatividade dos cientistas e sua capacidade de ver o potencial em uma técnica molecular básica e aplicá-lo a novos processos. O advento da PCR abriu muitas portas na pesquisa genética, incluindo um meio de análise de DNA e identificação de diferentes genes com base em suas seqüências de DNA.

A seqüenciamento de DNA também depende da nossa capacidade de usar eletroforese em gel para separar fios de DNA que diferem em tamanho por apenas um par de bases.

Seqüenciamento de DNA

No final da década de 1970, duas técnicas de seqüenciamento de DNA para moléculas de DNA mais longas foram inventadas. Estes eram o método Sanger (ou didesoxi) e o método Maxam-Gilbert (clivagem química). O método de Maxam-Gilbert é baseado em clivagem específica de nucleotídeos por produtos químicos e é melhor usado para seqüenciar os oligonucleótidos (polímeros de nucleotídeos curtos, geralmente menores que 50 pares de bases de comprimento). O método de Sanger é mais comumente usado porque foi provado tecnicamente mais fácil de aplicar e, com o advento da PCR e automação da técnica, é facilmente aplicado a longos fios de DNA, incluindo alguns genes inteiros. Esta técnica baseia-se na terminação da cadeia por didesoxinucleótidos durante as reacções de alongamento por PCR.

Método de Sanger

No método de Sanger, o fio de DNA a ser analisado é usado como modelo e a DNA polimerase é utilizada, em uma reação de PCR, para gerar fios de cortesia usando primers.

São preparadas quatro misturas de reacção de PCR diferentes, contendo cada uma uma certa percentagem de análogos de didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP) a um dos quatro nucleótidos (ATP, CTP, GTP ou TTP). A síntese da nova cadeia de DNA continua até que um desses análogos seja incorporado, momento em que a cadeia é prematuramente truncada.

Cada reação de PCR acabará contendo uma mistura de diferentes comprimentos de fios de DNA, terminando todos com o nucleótido que foi rotulado com didesoxi para essa reação. A eletroforese em gel é então usada para separar os fios das quatro reações, em quatro pistas separadas, e determinar a seqüência do modelo original com base em quais comprimentos de fios terminam com o nucleotídeo.

Na reação automatizada de Sanger, utilizam-se primers rotulados com quatro tags fluorescentes coloridas diferentes. As reacções de PCR, na presença dos diferentes nucleótidos didesoxi, são realizadas como descrito acima. No entanto, em seguida, as quatro misturas de reacção são então combinadas e aplicadas numa única pista de um gel. A cor de cada fragmento é detectada usando um feixe de laser e a informação é coletada por um computador que gera cromatogramas que mostram picos para cada cor, a partir dos quais a sequência de DNA do modelo pode ser determinada.

Normalmente, o método de seqüenciamento automatizado é apenas preciso para seqüências até um máximo de cerca de 700-800 pares de bases de comprimento. No entanto, é possível obter sequências completas de genes maiores e, de fato, genomas inteiros, usando métodos passo a passo, tais como Primer Walking e seqüenciamento de Shotgun.

Em

Primer Walking , uma porção viável de um gene maior é sequenciada usando o método de Sanger. Novos iniciadores são gerados a partir de um segmento confiável da seqüência e utilizados para continuar a seqüenciar a porção do gene que estava fora do alcance das reações originais. Sequência de espingarda

implica cortar aleatoriamente o segmento de DNA de interesse em fragmentos de tamanho mais apropriados (gerenciáveis), seqüenciar cada fragmento e organizar as peças com base em seqüências sobrepostas. Esta técnica foi facilitada pela aplicação de software para arrumar as peças sobrepostas.