Como a Reação em Cadeia de Polimerase Funciona para Amplificar Genes

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica genética molecular para fazer múltiplas cópias de um gene e também é parte do processo de seqüenciamento de genes.

Como funciona a reação em cadeia da polimerase?

As cópias de genes são feitas usando uma amostra de DNA e a tecnologia é boa o suficiente para fazer cópias múltiplas de uma única cópia do gene encontrado na amostra. A amplificação por PCR de um gene para fazer milhões de cópias, permite a detecção e identificação de sequências de genes usando técnicas visuais baseadas em tamanho e carga (+ ou -) do pedaço de DNA.

Em condições controladas, pequenos segmentos de DNA são gerados por enzimas conhecidas como DNA polimerases, que adicionam desoxinucleótidos complementares (dNTPs) a um pedaço de DNA conhecido como "modelo". Mesmo pedaços de DNA menores, chamados "primers", são usados ​​como ponto de partida para a polimerase. Primers são pequenos pedaços artificiais de DNA (oligômeros), geralmente entre 15 e 30 nucleótidos de comprimento. Eles são feitos sabendo ou adivinhar sequências de DNA curtas nas extremidades do gene que estão sendo amplificadas. Durante a PCR, o DNA que está sendo sequenciado é aquecido e os fios duplos se separam. Após o resfriamento, os primers se ligam ao modelo (chamado recozimento) e criam um lugar para a polimerase começar.

A técnica de PCR

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi possível graças à descoberta de termófilos e enzimas termófitas de polimerase (enzimas que mantêm a integridade estrutural e a funcionalidade após o aquecimento a altas temperaturas).

As etapas envolvidas na técnica de PCR são as seguintes:

• É criada uma mistura, com concentrações otimizadas do modelo de DNA, enzima polimerase, primers e dNTPs. A capacidade de aquecer a mistura sem desnaturando a enzima permite a desnaturação da dupla hélice da amostra de DNA a temperaturas na faixa de 94 graus Celsius.

• Após a desnaturação, a amostra é arrefecida para uma faixa mais moderada, em torno de 54 graus, o que facilita o recozimento (encadernação) dos iniciadores para os modelos de DNA de cadeia simples.
• Na terceira etapa do ciclo, a amostra é reaquecida a 72 graus, a temperatura ideal para Taq DNA Polymerase, para alongamento. Durante o alongamento, a DNA polimerase usa a única cadeia de DNA original como modelo para adicionar dNTPs complementares às extremidades 3 'de cada iniciador e gerar uma seção de DNA de cadeia dupla na região do gene de interesse.
• Os primers que recoaram as sequências de DNA que não são uma combinação exata não permanecem recozidos a 72 graus, limitando assim o alongamento ao gene de interesse.

Este processo de desnaturação, recozimento e alongamento é repetido múltiplo (30-40) vezes, aumentando exponencialmente o número de cópias do gene desejado na mistura.Embora este processo seja bastante tedioso se realizado manualmente, as amostras podem ser preparadas e incubadas em um termociclador programável, agora comum na maioria dos laboratórios moleculares, e uma reação de PCR completa pode ser realizada em 3-4 horas.

Cada passo de desnaturação interrompe o processo de alongamento do ciclo anterior, truncando assim o novo fio de DNA e mantendo-o aproximadamente ao tamanho do gene desejado.

A duração do ciclo de alongamento pode ser feita mais ou mais curta dependendo do tamanho do gene de interesse, mas, eventualmente, através de ciclos repetidos de PCR, a maioria dos modelos será restrita ao tamanho do gene de interesse sozinho , uma vez que terão sido gerados a partir de produtos de ambos os primers.

Existem vários fatores diferentes para o sucesso da PCR que podem ser manipulados para melhorar os resultados. O método mais utilizado para testar a presença de produto de PCR é a eletroforese em gel de agarose. O que é usado para separar fragmentos de DNA com base no tamanho e na carga. Os fragmentos são então visualizados usando corantes ou radioisótopos.

A Evolução

Desde a descoberta do PCR, DNA polimerases diferentes do Taq original foram descobertas. Alguns destes têm melhor capacidade de "revisão" ou são mais estáveis ​​em temperaturas mais elevadas, melhorando assim a especificidade da PCR e reduzindo os erros a partir da inserção do dNTP incorreto.

Algumas variações de PCR foram projetadas para aplicações específicas e agora são usadas regularmente em laboratórios de genética molecular. Alguns deles são PCR em tempo real e PCR de reversa-transcriptase. A descoberta de PCR também levou ao desenvolvimento de seqüenciamento de DNA, impressão digital de DNA e outras técnicas moleculares.