Amplificação de dNA através da reação em cadeia da polimerase

PCR representa a reação em cadeia da polimerase, uma técnica de biologia molecular para amplificar segmentos de DNA, gerando cópias múltiplas usando enzimas de DNA polimerase em condições controladas. Tão pouco quanto uma única cópia de um segmento de DNA ou gene pode ser clonada em milhões de cópias, permitindo a detecção usando corantes e outras técnicas de visualização.

Desenvolvido em 1983, o processo de PCR possibilitou realizar sequenciação de DNA e identificar a ordem dos nucleotídeos em genes individuais.

O método utiliza o ciclo térmico ou o aquecimento e resfriamento repetidos da reação para a fusão e replicação do DNA. À medida que o PCR continua, o "novo" DNA é usado como um modelo para replicação e uma reação em cadeia segue, exponencialmente ampliando o modelo de DNA.

As técnicas de PCR são aplicadas em muitas áreas da biotecnologia, incluindo engenharia de proteínas, clonagem, medicina forense (teste de DNA), teste de paternidade, diagnóstico de doenças hereditárias e / ou infecciosas e análise de amostras ambientais.

No caso da medicina forense, em particular, a PCR é especialmente útil porque amplifica mesmo a menor quantidade de evidência de DNA. O PCR também pode ser usado para analisar o DNA que tem milhares de anos, e essas técnicas têm sido usadas para identificar tudo, desde um mamute de 800 mil anos até mominhas de todo o mundo.

O procedimento de PCR é o seguinte:

• Inicialização: Este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que requerem PCR de inicialização a quente. A reacção é aquecida entre 94 e 96 ° C e mantida durante 1-9 minutos.

• Desnaturação: Se o procedimento não requer inicialização, a desnaturação é o primeiro passo. A reacção é aquecida a 94-98 ° C durante 20-30 segundos. As ligações de hidrogênio do modelo de DNA são interrompidas e as moléculas de DNA de cadeia simples são criadas.
• Recozimento: A temperatura da reacção é menor entre 50 e 65 ° C e mantida durante 20-40 segundos. Os iniciadores recobrem o modelo de DNA de cadeia simples. A temperatura é extremamente importante durante esta etapa. Se é muito quente, o iniciador pode não se ligar. Se estiver muito frio, o primário pode se ligar imperfeitamente. Uma boa ligação é formada quando a sequência do iniciador se aproxima da sequência do modelo.
• Extensão / Elongação: A temperatura durante este passo varia de acordo com o tipo de polimerase. A DNA polimerase sintetiza uma cadeia de DNA completamente nova.
• alongamento final: Este passo é realizado a 70-74 ° C durante 5-15 minutos após o ciclo de PCR final.
• Final hold: Este passo é opcional. A temperatura é mantida a 4-15 ° C e acelera a reação.

O procedimento é dividido em três estágios:

• Amplificação exponencial: Durante todo ciclo, o produto (o fragmento específico de DNA que está sendo replicado) é duplicado.
• Etapa de nivelamento: À medida que a DNA polimerase perde atividade e consome reagentes, a reação diminui.
• Plateau: Não há mais produtos acumulados.